O Mastino Napoletano tem temperamento muito forte. Desde filhote tem caráter firme e decidido, com poucos meses de vida, já reconhe o dono juntamente com seus familiares e olha com desconfiança para estranhos. A despeito de seu passado manchado de sangue, hoje o Mastino é um animal de vida pacata, servindo como mascote em muitos lares.

Ele se apresenta completamente devotado e obediente ao seu mestre. Consegue assimilar com facilidade tudo o que lhe for ministrado. O Mastino pode ser mantido quieto num canto o tempo todo que o seu dono o desejar. Da mesma forma que também atacará uma pessoa se o seu proprietário assim o determinar. Um verdadeiro Mastino não é do tipo espalhafatoso, encontrando-se constantemente em posição de descanso, somente se manifestando ou se movimentando de acordo com as ordens do seu mestre. Geralmente, a maioria dos Mastinos se apresentam com um corpo bastante pesado e roliço. Somente a sua presença, com seu tamanho, grande massa muscular e seu olhar frio e altivo, já são suficientes para amedrontar o invasor. Agora se o invasor mesmo assim insistir em entrar no seu território, prepare-se para um combate mortal, pois o Mastino lutará até o fim se for preciso, fazendo valer-se de toda sua história, e vida de combates. Quando mantido tão somente como cão de guarda, o cão se mostra altamente eficiente, uma vez que necessita somente ficar postado à entrada do local e manter-se atento a qualquer eventualidade.

O verdadeiro Mastino, ao ver se aproximar um desconhecido, espera-lo-ia ainda dar mais alguns passos, sempre sob sua vigilância, até encontrar-se em posição adequada para ataca-lo, posição esta que seu ataque é fulminante e certeiro, não dando a menor chance de defesa ou escapada ao inimigo. No universo canino existem certas raças, que se põe a latir tão logo divisam alguma pessoa estranha, com o mastim é diferente, ele raramente late, fica sempre observando, atento para o momento fatal.

A mordida do Mastino Napoletano é a mais forte de todo o reino canino, alcançando a 2 toneladas de pressão, por esse motivo é que a cabeça do Mastino Napoletano é tão exigida.